人血小板衍生生长因子 PDGF ELISA试剂盒

　　人血小板衍生生长因子 PDGF ELISA试剂盒

　　免疫测定技术的基础在于抗原之间的特异结合反应，所以任何的诊断试剂离不开的原料，如抗原，酶等。以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原，而则为纯化抗原免疫动物后获得的多克隆和使用杂交瘤技术得到的单克隆，而抗原或的标记物如酶标结合物则通过各种化学合成方法制备。近年来，随着分子生物学的发展，使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或及其酶结合物等免疫测定试剂已成为现实的新一代试剂，各种新型使用的测定方法也不断出现。

　　HBsAg试剂特点(检测模式:临床夹心法):包被为山羊多抗。多抗具有高亲和性和对抗原各种表位的反应性。酶表为与HBsAg有不同结合位点的鼠复合单位，可测得HBsAg变异样品，提高检测的特异性(99.98%)提高检测的灵敏度，应用Parl Ehrich 学说(PEI)HBsAg标准品，对ad标准品的灵敏度为0.05ng/ml对ay标准品灵敏度为0.025ng/ml

　　ELISA检测试剂盒应用定性夹心免疫检测技术，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板条，这些多肽是型HEV核心氨基酸序列中抗原性很强的肽段，分别来自于该的开放阅读框2和开放阅读框3。将样品或标准品加入孔中并孵育，如果其中存在HEV IgM，这些就会与HEV 的多肽抗原结合，并固定在上面，洗板除去其它非特异性和样品中的其它成份。然后加入羊抗人IgM-HRP(辣根过氧化物酶)酶结合物，经第二次孵育后，酶结合物就会与次孵育结合上的HEV IgM相结合，洗板除去未结合的酶结合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育时会发生酶-底物反应，只有那些含有HEV IgM和酶结合物所形成的复合物的孔才会发生颜色变化，加入溶液终止酶和底物间的反应，并在波长: 450nm处测量O.D.值,按照本HEV IgMelisa试剂盒的测试标准, O.D.值大于或等于Cut-Off值的样品被认为是初试阳性。

　　用途

　　ELISA的基础是抗原或的固相化及抗原或的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的或抗原)与固相载体表面的抗原或起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定。

　　然而，影响Elisa试验结果的因素很多，故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点。

　　特点

　　一、、灵敏、特异的;

　　二、稳定的重复性和可靠性;

　　三、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相载体;

　　四、适用血清、血浆、组织匀浆液、细胞培养上清液、尿液等等多种标本类型;

　　五、节省实验经费。

　　elisa试剂盒回收率是反应待测物在样品分析过程中的损失的程度，损失越少，回收率越高，如果作标液1PPM，就是1毫克/升，而作出标准数据为0.99毫克/升，就是说你的回收率是99%，这个与真实成分有密切的关系，说明方法的准确度。比如水中总无机氯含量测定，样品水中含有无机氯20mg/L，取100mL被测水样品，加入0.1mL浓度为10mg/mL的含无机氯标准样品，测定时忽略体积变化，如果测定出样品中无机氯为29.8mg/L，则认为回收率为99%。

　　制备方法

　　包括以下步骤:

　　1)抗原表位的计算机筛选;

　　2)抗原的制备;

　　3)血清的采集;

　　4)间接ELISA方法的建立;

　　5)间接ELISA方法的敏感性和特异性验证;

　　6)试剂盒的稳定性验证;

　　7)对屠宰场进行临床检测。该方法简单、快速、灵敏度高、特异性强、稳定性合格、重复性好。应用本发明制得的试剂盒能有效检出感染猪的戊型肝炎病毒，适用于大批量发病样本的检测，可用于猪戊肝的快速诊断，并预防、控制猪戊肝病毒的流行和阻断戊肝病毒由猪向人传播。

　　组成结构

　　1、 血清:操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血红细胞迅速小心地分离。

　　2、 血浆:EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。

　　3、 细胞上清液:1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。

　　4、 组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液。

　　5、 保存:如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

　　此IBL试剂盒能用于小鼠血清,EDTA血浆,细胞上清中白介素-6的定量检测

　　试剂盒成分

　　1 预包被板: 抗小鼠白介素-6兔子IgG,亲合纯化 96T

　　2 酶标记: (30倍浓缩)HRP标记抗小鼠白介素-6兔子IgG,亲合纯化 0.4mL x 1

　　3 标准品: 重组小鼠白介素-6 0.5mL x 2

　　4 EIA缓冲液: 含1% BSA, 0.05%吐温20 BPS 30mL x 1

　　5 标记稀释液: 含1% BSA, 0.05%吐温20 BPS 12mL x 1

　　6 显色剂: TMB底物液 15mL x 1

　　7 终止液: 1N 12mL x 1

　　8 浓缩洗涤液: (40倍浓缩) 含1% BSA, 0.05%吐温20 BPS 50mL x 1 操作说明 1实验所需器材(但试剂盒没有提供) 酶标仪(450nm) 微移液管及其吸嘴 量筒及烧杯 去离子水 冰箱(4°C) 坐标纸(log/log) 吸水纸 试管(用于标准品稀释) 温育箱(37°C ± 1°C) 洗瓶 (用于洗板) 一次性试剂管(用于浓缩酶标记和显色剂)

　　操作方法

　　双夹心法

　　1.包被:用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

　　2. 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

　　3. 加酶标:于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃ 孵育0.5~1小时，洗涤。

　　4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10~30分钟。

　　5. 终止反应:于各反应孔中加入2M0.05ml。

　　6. 结果判定:可于白色背景上，直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以"+"、"-"号表示。也可测OD值:在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

　　间接法

　　1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜;

　　2.次日洗涤3次;

　　3.加一定稀释的待检样品(未知)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤;

　　4.(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二(抗)0.1ml;

　　5.37℃孵育35-60分钟，洗涤;

　　6.'一遍用DDW洗涤。

　　其余步骤同"双夹心法"的4、5、6。

　　发展前景

　　临床测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。分子生物学正在并最终肯定会让对整个生命科学有一个而的认识，其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又有效的，对以前一些难以检测的生物活性物质的测定，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。

　　主要设备

　　试剂

　　(1) 包被缓冲液(PH9.60.05M碳酸盐缓冲液):

　　Na2CO3 1.59克

　　NaHCO3 2.93克

　　加蒸馏水至1000ml

　　(2) 洗涤缓冲液(PH7.4PBS):0.15M

　　KH2PO4 0.2克

　　Na2HPO4·12H2O 2.9克

　　NaCl 8.0克

　　KCl 0.2克

　　Tween-20 0.05% 0.5ml

　　加蒸馏水至1000ml

　　(3) 稀释液:

　　牛血清白蛋白(BSA) 0.1克

　　加洗涤缓冲液至100ml

　　或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5~10%使用。

　　(4) 终止液(3M H2SO4):

　　蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓(98%)21.7ml。

　　(5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸枣柠檬酸):

　　0.2MNa2HPO4(28.4克/L)25.7ml

　　0.1M柠檬酸(19.2克/L) 24.3ml

　　加蒸馏水50ml。

　　(6) TMB(四甲基联)使用液:

　　TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml

　　底物缓冲液(PH5.5) 10ml

　　0.75%H2O2 32μl

　　(7) ABTS使用液:

　　ABTS 0.5mg

　　底物缓冲液(PH5.5) 1ml

　　3%H2O2 2μl

　　(8) 抗原、和酶标记。

　　(9) 正常人血清和阳性对照血清。

　　器材

　　(1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。

　　(2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。

　　(3) 4℃冰箱，37℃孵育箱。

　　试验原理

　　试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA).已知浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将生物素标记的同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中的浓度呈比例关系。

　　自备材料

　　1. 蒸馏水。

　　2. 加样器:5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

　　3. 振荡器及磁力搅拌器等。

　　安全性

　　1. 避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。

　　2. 实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。

　　3. 不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

　　4. 试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。

　　5. 实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。

　　6. 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

　　7. 使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。

　　8. 使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。

　　9. 洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

　　10. 底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。

　　11. 加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。

　　12. 按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

　　测试要求

　　做好对照

　　正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

　　实验条件的选择

　　在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:

　　(1) 固相载体的选择:许多物质可作为固相载体，如聚、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选:用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。

　　(2) 包被(或抗原)的选择:将(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0~9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃ 18~24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定:即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg/ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1~10μg/ml。

　　(3) 酶标记工作浓度的选择:首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记部份)。然后再固定其它条件或采取"方阵法"(包被物、待检样品的参考品及酶标记分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

　　(4) 酶的底物及供氢体的选择:对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。

　　分装:

　　检测范围和灵敏度不同，用量少时，可使用分装，前期是它的长久性不是很好。

　　试剂盒的标准曲线点OD 值均在2.0±0.2，零孔的OD 值都控制在0.10以下。

　　试剂盒的标准曲线相关系数R≥0.98。

　　试剂盒重复性好，板内、板间变异系数均试剂的组份都多给20%的富余量，确保完成48/96孔的检测，避免分次检测可能造成试剂量不足的情况。

　　检测及酶结合物的稀释度合适(均为1:30), 方便试验操作者准确地做稀释工作，保证实验结果的重复性。

　　白介素6是一种细胞因子,已被证实为B细胞分化因子.它是一种形成系统,它的生理特性,如肝细胞急性蛋白合成的诱导和基于和白介素3协同作用的生长刺激等,也备受关注. 并且已证实白介素-6与病理学存在稳定的相关关系.例如,报道多种疾病的生长因子为白介素-6, 骨髓瘤细胞能合成白介素-6并表达白介素-6受体.此外, 白介素6在多种炎性疾病和自身免疫疾病发挥重要的作用. 此试剂盒能高灵敏度的检测小鼠血清和细胞基质上清的白介素6 原理 此试剂盒运用了两种特异性,洗板后加入TMB底物液显色,显色的强度与小鼠的白介素-6的量成正比. 检测范围 10.94的 700 pg/mL 预期用途

　　人血小板衍生生长因子 PDGF ELISA试剂盒 应用领域

　　ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，

　　可概括四个方面:

　　1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。

　　2、研究抗酶的合成。

　　3、显现微量的免疫沉淀反应。

　　4、定量检测体液中抗原或成份。

　　注意事项

　　ELISA试剂盒检测过程中的注意事项

　　一、ELISA实验通用规则

　　1、要保证移液枪的准确性，误差不能超过2%。可用水和电子天平进行确定。但有人员进行矫正。

　　2、要配备20ul、50ul、100ul、1000ul和排枪各一支。吸取不同的液体后，要更换枪头。即使是吸取标准品时。

　　3、要在实验前1小时将试剂盒从冰箱中取出，使各种试剂都恢复到室温，以使结果更稳定。

　　4、实验时，要使底物避光保存。

　　5、用枪吸取液体时速度不能太快，以免产生气泡而使吸取量不准确。

　　6、吸取液体时，要用量程和需要量接近的枪去吸，减少误差。

　　7、将液体加到酶标孔中时，避免枪头和孔内液体接触，可使枪头上的液滴和孔壁接触，液滴会自然流下去。

　　8、液体全部加完后，可将酶标板在桌子上平行轻轻晃动30秒，混匀液体。也可以用酶标仪的晃动功能。

　　9、温浴时，要用不干胶或胶带纸封好酶标板，防止水分的蒸发。

　　10、洗板时，每次洗液加入后，应静置1分钟，使清洗更加。没有洗板机时，倒去液体后，要将酶标板在报纸或毛纸上用力拍干。

　　11、洗液不够时，可用蒸馏水自行配制PH7.4，0.02M的磷酸缓冲液，加入0.1%的吐温20作为洗液。加入1/1000的叠氮钠后可长期保存。

　　12、底物是光敏感的，要在临用前现配。

　　13、检测前，要打开酶标仪，使之稳定10分钟以上。

　　14、底物有一定的毒性，终止液对皮肤有腐蚀性，应尽量避免接触。

　　15、待检样品要澄清，否则会影响结果。

　　16、温浴时间应遵守试剂盒规定。

　　17、应尽量做双孔实验，这样才能保证数据的准确性。

　　18、对结果有疑问的样品要用其它方法进行确证。